一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710844845.2 (22)申请日 2017.09.19 (71)申请人 苏州信宏天科技有限公司 地址 215164 江苏省苏州市吴中区太湖旅 游度假区孙武路2013号 (72)发明人 王洁 (74)专利代理机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 代理人 王新生 (51)Int.Cl. C12N 5/074(2010.01) C12N 5/071(2010.01) (54)发明名称 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法 (57)摘要 本发明涉及细胞人工培养技术。

2、领域， 尤其为 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 包括 以下步骤： 步骤1） 选取细胞种子； 步骤2） 细胞接 种培养； 步骤3） 悬浮培养； 步骤4） 将上述得到理 想细胞量置于低温条件下保存。 本一种药用鹿茸 细胞的提取培养及制备方法， 操作简单， 成本较 低， 生产周期快， 并且生产出的产品具有天然鹿 茸的相同药理作用， 本发明人经过十几年的反复 试验， 多次选择， 独创了鹿茸物质生产新方式， 使 其产品完全达到 “腊片” 水平， 经济开发源力深 远。 权利要求书2页 说明书6页 CN 107418927 A 2017.12.01 CN 107418927 A 1.一种药用鹿茸细胞。

3、的提取培养及制备方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 步骤1） 选取细胞种子： 从千头以上的鹿种群中挑选健康强壮的质量突出的个体， 并且 检查无疾病， 在其最佳生长时期提取原代细胞， 进行细胞培养； 步骤2） 细胞接种培养： 将原代细胞接种到第一细胞培养瓶中进行细胞培养， 且第一细 胞培养瓶中放置有细胞培养基， 经过严格选拔， 找出理想细胞进行大量增殖， 且进行不同代 数观察和保存； 步骤3） 悬浮培养： 将理想细胞转移至第二细胞培养瓶中， 且第二细胞培养瓶中放置有 细胞生长液， 使细胞生长液保持在适宜的时间、 温度、 PH、 通气量、 转速以及溶解氧等条件下 进行传代培养； 步骤4） 将上述。

4、得到理想细胞量置于低温条件下保存。 2.根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 其特征在于： 所述 步骤1） 中的鹿种群为梅花鹿或马鹿， 最佳生长周期为2-6周岁的幼鹿生长点， 提取方式为无 菌手术机械法。 3.根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 其特征在于： 所述 步骤2） 中的细胞接种量为103-107个/毫升培养基。 4.根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 其特征在于： 所述 步骤2） 中的细胞培养基配方为： MEM基础液 78%-80% 动物血清 （浓度） 1%-15% 氯化钠 （组分） 6000-8000mg/L 抗。

5、坏血酸 （组分） 3-8mg/L 葡萄糖 （组分） 1500-2000mg/L 亚油酸 （组分） 1-5mg/L 维生素D2 （组分） 1-3mg/L。 5.根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 其特征在于： 所述 步骤3） 中的细胞生长液配方为： MEM基础液 88%-90% 新生动物血清 （浓度） 1%-10% 氯化钠 （组分） 6000-7000mg/L 抗坏血酸 （组分） 4-6mg/L 葡萄糖 （组分） 1500-2000mg/L 亚油酸 （组分） 2-4mg/L 维生素D2 （组分） 2-3mg/L。 6.根据权利要求4或5所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制。

6、备方法， 其特征在于： 所述新生动物血清选用马血清、 牛血清、 狗血清、 人员血清中的一种或几种。 7. 根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 其特征在于： 所 述步骤3） 中的培养时间为5-10天， 温度为35-37， PH为7.1-7.3， 空气饱和通气量0.1Lpm- 0.3 Lpm， 转速为60-90rpm， 溶解氧55%-60%。 8.根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 其特征在于： 所述 权利要求书 1/2 页 2 CN 107418927 A 2 步骤3） 中的传代数为50-200代。 9.根据权利要求1所述的一种药用鹿茸细胞的提取培。

7、养及制备方法， 其特征在于： 所述 步骤4） 中的低温条件为-75至-185。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107418927 A 3 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞人工培养技术领域， 具体为一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备 方法。 背景技术 0002 鹿茸细胞是自然界中一种特殊的哺乳动物细胞， 在鹿体上正常分裂速度超过癌细 胞。 我国人民发现鹿茸药用已经有悠久历史， 其临床疗效， 保健作用卓著。 现代医学研究确 证了鹿茸的活性物质和药理机制， 国内外备受推崇。 0003 鹿茸生产有史以来均依赖于野生猎取或以人工家养方式获得鹿茸， 但是受自然界 。

8、和养殖条件束缚， 质量优劣悬殊， 生产水平有限。 鉴于此， 我们提出一种药用鹿茸细胞的提 取培养及制备方法。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 以解决上述背 景技术中提出的问题。 0005 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 包括以下步骤： 0007 步骤1)选取细胞种子： 从千头以上的鹿种群中挑选健康强壮的质量突出的个体， 并且检查无疾病， 在其最佳生长时期提取原代细胞， 进行细胞培养； 0008 步骤2)细胞接种培养： 将原代细胞接种到第一细胞培养瓶中进行细胞培养， 且第 一细胞培养瓶中。

9、放置有细胞培养基， 经过严格选拔， 找出理想细胞进行大量增殖， 且进行不 同代数观察和保存； 0009 步骤3)悬浮培养： 将理想细胞转移至第二细胞培养瓶中， 且第二细胞培养瓶中放 置有细胞生长液， 使细胞生长液保持在适宜的时间、 温度、 PH、 通气量、 转速以及溶解氧等条 件下进行传代培养， 得到理想细胞量， 并在低温条件下保存； 0010 步骤4)将上述得到理想细胞量置于低温条件下保存。 0011 优选的， 所述步骤1)中的鹿种群为梅花鹿或马鹿， 最佳生长周期为2-6 周岁的幼 鹿生长点， 提取方式为无菌手术机械法。 0012 优选的， 所述步骤2)中的细胞接种量为103-107个/毫升。

10、培养基。 0013 优选的， 所述步骤2)中的细胞培养基配方为： 说明书 1/6 页 4 CN 107418927 A 4 0014 0015 优选的， 所述步骤3)中的细胞生长液配方为： 0016 0017 优选的， 所述新生动物血清选用马血清、 牛血清、 狗血清、 人员血清中的一种或几 种。 0018 优选的， 所述步骤3)中的培养时间为5-10天， 温度为35-37， PH为 7.1-7.3， 空气 饱和通气量0.1Lpm-0.3Lpm， 转速为60-90rpm， 溶解氧55-60。 0019 优选的， 所述步骤3)中的传代数为50-200代。 0020 优选的， 所述步骤4)中的低温条。

11、件为-75至-185。 0021 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 本一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备 方法， 操作简单， 成本较低， 生产周期快， 并且生产出的产品具有天然鹿茸的相同药理作用， 本发明人经过十几年的反复试验， 多次选择， 独创了鹿茸物质生产新方式， 使其产品完全达 到 “腊片” 水平， 经济开发源力深远。 具体实施方式 0022 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的 实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，。

12、 都 属于本发明保护的范围。 说明书 2/6 页 5 CN 107418927 A 5 0023 实施例一 0024 本发明提供一种技术方案： 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 包括以下 步骤： 0025 步骤1)选取细胞种子： 从千头以上的鹿种群中挑选健康强壮的质量突出的个体， 并且检查无疾病， 在其最佳生长时期提取原代细胞， 进行细胞培养； 0026 步骤2)细胞接种培养： 将原代细胞接种到第一细胞培养瓶中进行细胞培养， 且第 一细胞培养瓶中放置有细胞培养基， 经过严格选拔， 找出理想细胞进行大量增殖， 且进行不 同代数观察和保存； 0027 步骤3)悬浮培养： 将理想细胞转移至第二。

13、细胞培养瓶中， 且第二细胞培养瓶中放 置有细胞生长液， 使细胞生长液保持在适宜的时间、 温度、 PH、 通气量、 转速以及溶解氧等条 件下进行传代培养； 0028 步骤4)将上述得到理想细胞量置于低温条件下保存。 0029 作为本发明一实施例， 所述步骤1)中的鹿种群为梅花鹿， 最佳生长周期为2周岁的 幼鹿生长点， 提取方式为无菌手术机械法。 0030 作为本发明一实施例， 所述步骤2)中的细胞接种量为103个/毫升培养基。 0031 作为本发明一实施例， 所述步骤2)中的细胞培养基配方为： 0032 0033 作为本发明一实施例， 步骤3)中的细胞生长液配方为： 0034 说明书 3/6 页。

14、 6 CN 107418927 A 6 0035 作为本发明一实施例， 新生动物血清选用马血清。 0036 作为本发明一实施例， 步骤3)中的培养时间为5天， 温度为35， PH 为7.1， 空气饱 和通气量0.1Lpm， 转速为60rpm， 溶解氧55。 0037 作为本发明一实施例， 步骤3)中的传代数为50-200代。 0038 作为本发明一实施例， 步骤4)中的低温条件为-75。 0039 采用本发明实施例鹿茸细胞的工业化效果为： 培养瓶中， 每毫升细胞液可获得细 胞1.0X108以上， 每台体积2.7-3.0M3转机生产1.5X104毫升细胞液， 在15000M2配备20台转机 的生。

15、产车间可年产1.55X104立升鹿茸细胞。 0040 实施例二 0041 本发明提供一种技术方案： 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 包括以下 步骤： 0042 步骤1)选取细胞种子： 从千头以上的鹿种群中挑选健康强壮的质量突出的个体， 并且检查无疾病， 在其最佳生长时期提取原代细胞， 进行细胞培养； 0043 步骤2)细胞接种培养： 将原代细胞接种到第一细胞培养瓶中进行细胞培养， 且第 一细胞培养瓶中放置有细胞培养基， 经过严格选拔， 找出理想细胞进行大量增殖， 且进行不 同代数观察和保存； 0044 步骤3)悬浮培养： 将理想细胞转移至第二细胞培养瓶中， 且第二细胞培养瓶中放 置有细。

16、胞生长液， 使细胞生长液保持在适宜的时间、 温度、 PH、 通气量、 转速以及溶解氧等条 件下进行传代培养； 0045 步骤4)将上述得到理想细胞量置于低温条件下保存。 0046 作为本发明一实施例， 步骤1)中的鹿种群为梅花鹿， 最佳生长周期为4 周岁的幼 鹿生长点， 提取方式为无菌手术机械法。 0047 作为本发明一实施例， 步骤2)中的细胞接种量为104个/毫升培养基。 0048 作为本发明一实施例， 步骤2)中的细胞培养基配方为： 0049 0050 作为本发明一实施例， 步骤3)中的细胞生长液配方为： 0051 说明书 4/6 页 7 CN 107418927 A 7 0052 00。

17、53 作为本发明一实施例， 新生动物血清选用马血清和牛血清混合血清。 0054 作为本发明一实施例， 步骤3)中的培养时间为7天， 温度为36， PH 为7.2， 空气饱 和通气量0.2Lpm， 转速为75rpm， 溶解氧60。 0055 作为本发明一实施例， 步骤3)中的传代数为100代。 0056 作为本发明一实施例， 步骤4)中的低温条件为-100。 0057 采用本发明实施例鹿茸细胞的工业化效果为： 培养瓶中， 每毫升细胞液可获得细 胞3.0X108以上， 每台体积2.7-3.0M3转机生产1.5X104毫升细胞液， 在15000M2配备20台转机 的生产车间可年产5.1X104立升鹿。

18、茸细胞。 0058 实施例三 0059 本发明提供一种技术方案： 一种药用鹿茸细胞的提取培养及制备方法， 包括以下 步骤： 0060 步骤1)选取细胞种子： 从千头以上的鹿种群中挑选健康强壮的质量突出的个体， 并且检查无疾病， 在其最佳生长时期提取原代细胞， 进行细胞培养； 0061 步骤2)细胞接种培养： 将原代细胞接种到第一细胞培养瓶中进行细胞培养， 且第 一细胞培养瓶中放置有细胞培养基， 经过严格选拔， 找出理想细胞进行大量增殖， 且进行不 同代数观察和保存； 0062 步骤3)悬浮培养： 将理想细胞转移至第二细胞培养瓶中， 且第二细胞培养瓶中放 置有细胞生长液， 使细胞生长液保持在适宜。

19、的时间、 温度、 PH、 通气量、 转速以及溶解氧等条 件下进行传代培养； 0063 步骤4)将上述得到理想细胞量置于低温条件下保存。 0064 作为本发明一实施例， 步骤1)中的鹿种群为梅花鹿， 最佳生长周期为6 周岁的幼 鹿生长点， 提取方式为无菌手术机械法。 0065 作为本发明一实施例， 步骤2)中的细胞接种量为107个/毫升培养基。 0066 作为本发明一实施例， 步骤2)中的细胞培养基配方为： 说明书 5/6 页 8 CN 107418927 A 8 0067 0068 作为本发明一实施例， 步骤3)中的细胞生长液配方为： 0069 0070 作为本发明一实施例， 新生动物血清选用。