脑梗死又称缺血性脑卒中,是指因脑部供血障碍,缺血、缺氧所导致的局限性脑组织缺血性坏死或软化,属中医“中风病”范畴。通络化痰胶囊(Tongluo Huatan Capsule,THC)有活血通络、化痰熄风的功效,用于治疗中风病中经络痰瘀阻络证。团队课题组前期已完成该药Ⅳ期临床试验资料采集,但未对数据进行总结,现基于前期收集的临床数据进行系统性总结及分析,进一步评价通THC治疗中风恢复期的疗效和安全性。同时,基于中医“异病同治”思想,痰瘀阻络证也是缺血性卒中后引发血管性痴呆(Vescular Dementia,VD)常见证型,由此提出假设:THC对VD是否也会有效?据最新研究显示,上调网格蛋白(clathrin)及其内吞标记物Rab5B能够促进神经元表面N-甲基D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)的内吞,减少神经元膜表面的NMDAR分布,从而减轻兴奋性氨基酸毒性造成的神经元损伤,改善VD大鼠学习记忆能力,但是clathrin和NMDA受体在这一过程中各个时点的变化还未明确。故本研究拟针对VD大鼠模型,早期给药干预后造模,取海马组织,按照造模后3h/1d/3d/7d/14d不同时点,采用动物行为学及Western blotting(WB)、RT-PCR检测clathrin及其内吞标记物Rab5B、NMDAR1(NMDAR功能亚单位)的表达,探索脑缺血再灌注海马神经元clathrin介导的NMDA受体胞吞过程动态变化特点,同时探讨THC在VD早期干预中可能存在的作用,从而从微观表征层面证明中药异病同治的疗效。临床研究目的:进一步评价THC治疗中风病中经络恢复期痰瘀阻络证患者的疗效和安全性,为临床用药提供参考。方法:采用多中心、前瞻性、单臂队列临床研究,纳入34家二级甲等以上医院中符合西医脑梗死恢复期及中医中风病中经络痰瘀阻络证诊断标准的病例,予THC治疗4周。运用统计学方法对课题组前期采集的临床试验数据进行分析。以美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评定神经功能缺损,中医证候评分及改良Rankin量表(Modified Rankin Scale,mRS)为疗效评价指标;以血常规、肝功能、肾功能为安全性评价指标。结果:(1)2012年01月-2016年12月于34家二级甲等以上的医院纳入的受试者共2169例,THC治疗后神经功能缺损综合疗效、中医证候疗效总有效率分别为84.09%、81.01%;mRS总分减少50%及以上者817例(37.67%),总分下降至0-1者1187例(54.73%);(2)影响NIHSS综合疗效的多因素分析显示年龄(OR=1.024,95%CI 1.009-1.039,P=0.002)、基线合并高血压(OR=4.720,95%CI 3.513-6.341,PP=0.000)、冠心病(OR=2.601,95%CI 1.530-4.421,P=0.000)、高脂血症(OR=2.234,95%CI1.234-4.407,P=0.008)、基线 NIHSS 评分(OR=0.902,95%CI 0.849-0.957,P=0.001)影响临床神经功能缺损程度综合疗效。(3)影响中医证候疗效的多因素分析显示基线中医证候评分对中医证候疗效有影响(OR=62.023,95%CI 37.407-113.026,P=0.000);(4)影响mRS改善的多因素分析显示年龄(OR=1.019,95%CI 1.007-1.031,P=0.001)、基线合并高血压(OR=2.898,95%CI 2.144-3.917,P=0.000)冠心病(OR=3.625,95%CI 1.516-8.673,P=0.004)对 mRS 的改善有影响;(5)THC不良反应总体发生率为0.00%。结论:(1)THC在中风恢复期的治疗中单用或联用其他西医基础治疗对于改善患者神经功能缺损程度、减轻残障及中医症状均有较好的疗效及安全性。(2)THC在中风恢复期的治疗中,年龄小、基线病情轻、没有基础疾病的患者疗效越好。实验研究目的:(1)探索VD大鼠海马区神经元clathrin介导的NMDA受体胞吞过程动态变化特点;(2)探索THC在VD早期干预中可能存在的作用。方法:大鼠适应性饲养7天后随机分为假手术组、模型组、THC组、美金刚组(MH组)、参知健脑方组(SZJN组),分别予相应药物灌胃,假手术组、模型组予等量的蒸馏水灌胃,1次/日,连续7日。采用2VO+腹腔注射硝普纳的方法制备VD大鼠模型,假手术组大鼠分离双侧颈总动脉但不夹闭血管,不注射硝普钠。造模后进行跳台实验、新物体识别实验、Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力;造模后3h、1d、3d、7d、14d分别取大鼠海马组织通过RT-PCR、WB检测海马clathrin、NMDAR1、Rab5B在造模后不同时间点的表达水平。结果:(1)行为学①跳台试验(模型评价)结果显示:假手术组大鼠与正常组大鼠相比潜伏期以及错误次数无统计学差异;VD大鼠与正常组、假手术组相比,潜伏期缩短,错误次数增加(P0.05);②新物识别实验,模型组与假手术组比较,新物辨别指数下降(P0.01);THC组、SZJN组、MH组辨别指数均比模型组高(P0.01);③水迷宫:各组大鼠逃避潜伏期均有不同程度缩短(P0.01)。不同分组对逃避潜伏期的影响有差异(P0.05),模型组与其他四组大鼠相比逃避潜伏期延长;撤去平台后,模型组与其他四组大鼠相比在目标限停留时间缩短(P0.01)。和模型组相比,假手术组、SZJN组穿越平台次数增加(P0.01)。(2)病理学HE染色显示,假手术组海马CA1区结构形态未见异常,神经元形态完整,排列整齐,胞核与胞质界限清晰可见无坏死。VD大鼠海马CA1区神经元形态不完整,排列紊乱,间隙增大,胞质稀少,神经元胞核深染,固缩呈三角形或不规则形,核仁不明显。造模后随着时间延长,VD大鼠海马CA1区神经元形态排列紊乱程度加重,间隙增加明显。与模型组比较,THC组、SZJN组大鼠海马CA1区整体组织损伤情况均有明显改善,神经元排列较为整齐,细胞形态结构较完整,胞质较均匀,胞核与胞质界限较清晰,少数细胞核深染、固缩,呈三角形或不规则形,核仁不明显。MH组大鼠海马CA1区细胞层次减少,神经元排列稀松,形态较模型组有明显改善,部分细胞核深染、固缩,呈三角形或不规则形。尼氏染色显示,假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列整齐紧凑,染色后呈现为颗粒或状块状,染色浓密且规则。VD大鼠海马CA1区神经元排列散乱,造模后随着时间延长,细胞带出现了断裂,细胞凋亡数量增加,大量神经细胞出现尼氏体碎裂。THC组、SZJN组海马CA1区神经细胞排列较为整齐,少数细胞间隙增宽,细胞带稍有变薄,少量的神经细胞可见到有尼氏体碎裂、胞质中央尼氏小体消失。MH组海马CA1区神经元细胞形态和排列较模型组有所改善,部分神经元细胞凋亡,细胞带变薄。RT-PCR结果①与假手术组相比,造模后3h、1d、3d、7d、14dVD大鼠clathrin mRNA表达均减少(P0.01)。与模型组相比,MHG组(P0.01)、THC组(P0.01)、SZJN组(P0.01)大鼠海马clathrin mRNA相对表达量增加;②与假手术组相比,术后3h、7d、14d模型组大鼠NMDAR1 mRNA表达增加(P0.01),术后1d NMDAR1 mRNA表达下降(P0.01);与模型组相比,术后3h SZJN组NMDAR1 mRNA 表达降低(P0.01),术后 7d、14dMH 组(P0.01)、THC 组(P0.01)、SZJN组(P0.01)NMDAR1 mRNA 表达降低;③与假手术组相比,术后3h、1d、3d、7d、14d VD大鼠Rab5B mRNA表达均减少(P0.01)。与模型组相比,术后 3h、1d、3d、7d、14dMH 组(P0.01)、THC 组(P0.01)、SZJN组(P0.01)大鼠海马Rab5B mRNA相对表达量增加。(3)WB结果①与假手术组相比,术后3h、1d、3d、7d、14d模型组大鼠clathrin蛋白表达均减少(P0.01)。与模型组相比,THC组大鼠在术后3h(P0.01)、1d(P0.05)clathrin 蛋白表达升高,SZJN 组在术后 3h(P0.01)、1d(P0.05)、7d(P0.05)、14d(P0.05)clathrin蛋白表达升高,MH组在术后3h(P0.01)clathrin蛋白表达增加。②与假手术组相比,术后3h(P0.01)、7d(P0.01)、14d(P0.01)模型组大鼠的膜蛋白NMDAR1表达增加,术后1d表达减少(P0.01);与模型组相比,THC组大鼠术后3h(P0.05)、7d(P0.01)NMDAR1表达减少,1d时表达增多(P0.01),SZJN组、MH组大鼠术后3h、7d NMDAR1表达减少(P0.01)。结论:(1)THC早期干预可减轻VD大鼠海马CA1区的病理损伤,提高学习及记忆能力,具有脑保护作用;(2)VD大鼠在脑缺血再灌注损伤后,海马神经元NMDAR1表达的动态演变在造模后先升后降再上升。clathrin及Rab5B表达降低导致神经元表面NMDAR内吞减少加重了兴奋性氨基酸毒性,导致学习记忆能力降低。(3)THC早期干预VD大鼠,可通过上调clathrin表达使神经元表面的NMDAR内吞增加,或下调NMDAR表达来减少兴奋性毒性作用对神经元的损伤,从而起到脑保护作用。
